FRET（荧光共振能量转移）

荧光共振能量转移 (FRET) 是一种在分子尺度上表征距离相关相互作用的强大技术。它是为数不多的能够测量体内和体外分子间和分子内距离相互作用的工具之一. FRET 涉及通过其吸收光谱内的入射光激发供体荧光团。这种辐射吸收将供体荧光团提升到更高能量的激发态，该激发态通常会以特征发射光谱辐射衰减（返回基态）。如果另一个荧光团分子（受体）存在于供体附近，其能量状态的特征是吸收光谱与供体的发射光谱重叠，则供体和受体之间存在非辐射能量转移的可能性。图1显示了青色荧光蛋白（CFP）发射光谱和黄色荧光蛋白（YFP）吸收光谱的重叠；这对支持强大的 FRET 相互作用。

图 1：CFP（供体）和 YFP（受体）吸收和发射光谱。

CFP 发射和 YFP 吸收（阴影区域）之间的重叠导致有效的 FRET 相互作用。

***能量转移由供体和受体荧光团分子之间的偶极-偶极相互作用（范德华力）介导，其变化为两个分子之间距离的倒数 6 次方。从供体到受体的能量转移速率大约为 k_F     k_F~k_D(r₀/r)⁶

其中 k_D是供体荧光团的辐射衰减率，或在没有受体荧光团的情况下荧光发射寿命的倒数（通常为 1 – 50 ns），r 是两个分子之间的距离， r₀
是“"Förster距离”，表征能量传输的 50% 效率点。FRET 适用于测量 FRET is suited to measuring changes in Förster 距离数量级的距离变化，通常为 20 到 90 Å.

在能量从供体转移到受体后，受体荧光团被激发到其荧光发射状态。因为从受体观察到的荧光发射速率受从供体到受体的能量转移的速率限制，所以 FRET 发射的定量测量可以使用上述方程提供距离的推断测量。准确的 FRET 测定通常涉及比较有和没有受体存在的样品中的供体和供体-受体荧光发射强度。比率测量是必要的，因为如图 1 所示，供体和受体发射光谱之间通常存在重叠，因此，很难通过单次测量准确确定使用受体发射滤光片测量的荧光的哪一部分仅来自受体。荧光寿命测量为能量转移率提供更直接的结果，不易受浓度变化的影响，并且可以使用时域或相位调制寿命测量技术进行。 

FRET 应用通常以非常低的分子荧光团浓度为特征。使用精心优化的滤光片对于检测微弱的荧光发射信号至关重要。Semrock BrightLine® 荧光滤光片提供尽可能高的透射率，以最/大化 FRET 发射信号，以及精心优化的透射通带深度阻挡，以实现最大可能的信号背景比（最高对比度）。

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图 2：用于定量测量供体发射的 CFP 激发片、二向色和发射片（来自 BrightLine FRET-CFP/YFP-A 滤光片组）

图 3：带有 YFP 发射滤光片（来自 BrightLine FRET-CFP/YFP-A 滤光片组）的CFP 激发片和二向色滤光片，用于受体发射的定量测量。

可以使用两个不同的滤光片组（立方体）依次进行这两个测量，其中每个滤光片组（立方体）具有相同的激发滤光片和二向色滤光片，但发射滤光片不同。不推荐这种方法，因为滤光片立方体之间的像素偏移会使测量结果失真，并且更换滤光片立方体需要相对较长的时间并导致样品振动，从而影响感兴趣分子之间的距离。相反，建议使用更快速、低振动的滤光片切换或真正同时检测供体和受体发射，尤其是在对移动的活细胞样本执行 FRET 时。对于那些选择使用两个单独的滤光片立方体的人来说，选择旨在
消除像素偏移的滤光片组很重要 以获得最准确的测量值。

使用发射滤光轮可以实现快速、低振动的滤光片更换。这是用于宽视场 FRET 测量的最常见的显微镜配置。一些研究人员更喜欢使用双滤光片转轮系统（一个用于激发片，一个用于发射片）的灵活性，尽管这种系统在软件控制方面更昂贵且更复杂。对于双滤光片转轮系统，最/好/的滤光片组选择是 Sedat 多波段组。最后，还可以使用两个摄像头同时检测供体和受体发射通道。一些制造商为此应用制造显微镜附件。除了标准的 FRET 滤光片组外，还需要一个额外的二向色分束镜来分隔附件中的两个发射路径。

荧光滤光片简介

一个分子吸收其吸收谱带波长范围（即吸收光谱）内的光，然后几乎瞬间发出较长的、位于其发射谱带波长范围（即发射光谱）内的光，此时，就会发生光学荧光。为了达到分析的目的，强的荧光分子，亦被称为荧光团、荧光染料，专门用于连接到生物分子或其他感兴趣的目标，用于鉴定、定量、甚至实时观察物质的生物和化学活性。荧光染料因为具有*的灵敏度、高特异性和简单性，被广泛应用于生物技术和分析检测中。大多数荧光仪器，包括荧光显微镜，都是基于光学滤光片。

一个典型的系统有三个基本的滤光片组成：激发滤光片（或吸收滤光片），二向色镜分束镜（或二向分色镜）和发射滤光片（或阻挡滤光片）。激发滤光片通常是一个带通滤光片，它只透过荧光染料的吸收波长，从而最大限度地减少荧光的其他来源的激发光和阻挡荧光发射带内的激发光。二向色镜分束镜是一种边缘滤光片，用于斜角入射 （通常是 45 °），以有效地反射激发波段的光和透射发射波段的光。Semrock 发射滤光片通常是一个带通滤光片，仅透过荧光染料的发射波长，并阻挡这个波段之外的所有不需要的光 - 尤其是激发光。通过滤光片阻挡不需要的激发能量（包括紫外和红外）或样品和系统的自发荧光，就可以得到具有黑暗背景的荧光图像。

我们可以通过选择适当的光学滤光片，组成一个滤光片组，用于观察荧光或者对荧光进行成像，这样就可以达到使一个给定的荧光染料可视化的目的。因为不同荧光染料的激发光谱和发射光谱不同，滤光片组需要优化，才可以用于不同荧光染料的同时成像。在不同的实验条件下使用同一个荧光染料时，滤光片组也需要优化。